A “Keresztelő Szent János” festményt a művész az 1500-as évek elején készítette el, amit egy angyal vázlata emelt kezével a John pózában rögzített, körülbelül 1504-es lapra rögzítve. Leonardo második milánói tartózkodása alatt kezdett dolgozni rajta, és Rómában folytatta a munkát.
Nyilvánvaló, hogy maga a mester szerint a vászon soha nem készült, a munkája még Amboise-ban is folytatódott. Egy fiatalember emelt kezével és testéhez nyomja egy kereszttel, a kép sötét tereiből világos sziluetttel néz ránk. Áramló fürtök enyhén pislognak a sötét keretben, ez a gyönyörű arc, titokzatosan hívó mosollyal és mozdulatlan pillantással, amelyet sötét szemhéjfesték vesz körül.
Az arcvonások egyértelműen olvassák a hasonlóságot a Monna Lisa-val, kissé félreérthető karaktert adva neki. Az ábra virágzó, érzékileg remegő formákat visel, és csak a kereszt, mintha a kép térében oldódna fel, azt mondja, hogy előttünk van Keresztelő János.